綠膿桿菌在自然界分布甚廣，空氣、水、土壤中均有存在。對(duì)人有致病力，常引起人皮膚化膿感染，特別是燒傷、燙傷、眼部疾病患者被感染后，常使病情惡化，并可引起敗血癥，因此，在化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定不得檢出綠膿桿菌。
一、方法提要
根據(jù)本菌生物學(xué)特征：革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42條件下生長等，可與類似菌相區(qū)別。
二、培養(yǎng)基和試劑
1、SCDLP 液體培養(yǎng)基 見GB 7918.1-87《化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 總則》。
2、十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基
成分：牛肉膏 3g 蛋白胨 10g 氯化鈉 5g 十六烷三甲基溴化銨 0.3g 瓊脂 20g 蒸餾水 1000ml
制法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調(diào)pH為7.4～7.6，加入瓊脂，115(10 1b)20min滅菌后，制成平板備用。
3、乙酰胺培養(yǎng)基
成分：乙酰胺 10.0g 氯化鈉 5.0g 無水磷酸氫于鉀 1.39g 無水磷酸二氫鉀 0.73g 硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.5g
酚紅 0.012g 瓊脂 20g 蒸餾水 1000ml
制法：除瓊脂和酚紅外，將其他成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)pH為7.2，加入瓊脂、酚紅，121(15 1b)20min高壓滅菌后，制成平板備用。
4、綠膿菌色素測(cè)定用培養(yǎng)基
成分：蛋白胨 20g 氯化鎂 1.4g 硫酸鉀 10g 瓊脂 18g 甘油(化學(xué)純) 10g 蒸餾水 1000ml
制法：將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加溫使溶解，調(diào)pH至7.4，加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內(nèi)，115(10 1b)20min高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆谩?/span>
5、明膠培養(yǎng)基
成分：牛肉膏 3g 蛋白胨 5g 明膠 120g 蒸餾水 1000ml
制法：取各成分加在蒸餾水中浸泡20min，隨時(shí)攪拌加溫使溶解，調(diào)pH至7.4，分裝于試管內(nèi)，經(jīng)115(10 1b)20min滅菌后，直立制成高層備用。
6、硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基
成分： 蛋白胨 10g 酵母浸膏 3g 硝酸鉀 2g 亞硝酸鈉 0.5g 蒸餾水 1000ml
制法：將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中，加溫使溶解，調(diào)pH為7.2，煮沸過濾后補(bǔ)足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，115(10 1b)20min滅菌后備用。
7、普通瓊脂斜面培養(yǎng)基
成分：蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 氯化鈉 5g 瓊脂 15g 蒸餾水 1000ml
制法：除瓊脂，將其余成分溶解于蒸餾水中，調(diào)pH為7.2～7.4，加入瓊脂，加熱溶解，分裝試管，121(15 1b)15min高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆谩?/span>
三、儀器
培養(yǎng)箱：37、42度 錐形燒瓶 試管 滅菌平皿 滅菌刻度吸管 顯微鏡 載玻片 接種針、接種環(huán) 電爐 高壓消毒鍋
四、操作步驟
1、增菌培養(yǎng)：取1：10樣品稀釋液10ml加到90ml SCDLP液體培養(yǎng)基中，置37培養(yǎng)18～24h。如有綠膿桿菌生長，培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。
注：如無SCDLP液體培養(yǎng)基時(shí)，可用普通肉湯培養(yǎng)基。檢驗(yàn)含防腐劑的化妝品時(shí)，在每1000ml普通肉湯中加1g卵磷脂、7g吐溫80。
2、分離培養(yǎng)：從培養(yǎng)液的薄菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上，置37培養(yǎng)18～24h。凡綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無守型，向周邊擴(kuò)散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴(kuò)散有水溶性色素，此培養(yǎng)基選擇性強(qiáng)，大腸艾希氏菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長較差。
在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時(shí)也可用乙酰胺培養(yǎng)基進(jìn)行分離，將菌液劃線接種于平皿中，放37培養(yǎng)24H，綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基略帶紅色，其他菌不生長。
3、染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應(yīng)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)。
4、氧化酶試驗(yàn)：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi)，用無菌玻璃棒挑取綠膿桿菌可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1％二甲基對(duì)苯二胺試液，在15～30s之內(nèi)，出現(xiàn)粉紅色或紫紅色時(shí)，為氧化酶試驗(yàn)陽性，若培養(yǎng)物不變色，氧化酶試驗(yàn)陰性。
5、綠膿菌素試驗(yàn)：取可疑菌落2～3個(gè)，分別接種在綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基上，置37培養(yǎng)24h，加入氯仿3～5ml，充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液內(nèi)，待氯仿提取液呈藍(lán)色時(shí)，用吸管將氯仿移到另一試管中并加入1N的鹽酸1ml左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時(shí)為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。
6、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)：挑取被檢的純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置37培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。凡在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體者，即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)狻?/span>
7、明膠液化試驗(yàn)：取綠膿桿菌可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置37培養(yǎng)24h，取出放冰箱10～30min，如仍呈溶解狀時(shí)即為明膠液化試驗(yàn)陽性，如凝固不溶者為陰性。
8、42生長試驗(yàn)：挑取純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，放在41～42培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24～48h，綠膿桿菌能生長，為陽性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長。
五、檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告
被檢樣品增菌分離培養(yǎng)后，經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗(yàn)皆為陽性者，即可報(bào)告被檢樣品中檢出有綠膿桿菌。如綠膿菌素試驗(yàn)陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和４２生長試驗(yàn)三者皆為隉性時(shí)，仍可報(bào)告被檢樣品中有綠膿桿菌。
附加說明：
本標(biāo)準(zhǔn)由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測(cè)所歸口。
本標(biāo)準(zhǔn)由“化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法”起草小組起草。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人周淑玉。
本標(biāo)準(zhǔn)由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測(cè)所負(fù)責(zé)解釋
注解：
1、分離綠膿桿菌常用以下幾種培養(yǎng)基：
1）十六烷三甲基溴化銨瓊脂（CA）
2）明膠十六烷三甲基溴化銨瓊脂（GCA）
成分為：蛋白陳20g，無水氯化鎂1.4g，無水硫酸鉀10g，明膠（BG）75g，瓊脂18～20g，十六烷三甲基溴化銨（cetrimide）0.3g，甘油（CP）10ml，蒸餾水1000ml， pH7.6。在本平板上可直接觀察是否液化明膠（菌落周圍有液化環(huán)），并可測(cè)試氧化酶和綠膿色素，提前診斷。
上述這兩種培養(yǎng)基具有較強(qiáng)的選擇性和鑒別作用，除綠膿桿菌和極少數(shù)假單胞菌及革蘭氏陰性桿菌可以生長外，絕大部分革蘭氏陰性桿菌，假單胞菌及革蘭氏陽性菌的生長，完全受到抑制。因?yàn)榫G膿桿菌具有可利用十六烷的溴化銨鹽這一重要特性，故很多國家已普遍利用此特性分離該菌，證明效果很好。但往往出現(xiàn)無色素、菌落較小、無蔓延生長等現(xiàn)象，因此在選取菌落時(shí)須注意，以免漏檢。
3）乙酰胺瓊脂培養(yǎng)基（Acetamide）主要成分為乙酰胺。乙酰胺酶是綠膿桿菌特有的酶類。綠膿桿菌能分解乙酰胺，故在此培養(yǎng)基上能生長，而其他菌不生長。
4）NAC瓊脂培養(yǎng)基，其成分為：蛋白陳20g、磷酸氫二鉀和硫酸鎂各0.3g，十六烷三甲基溴化胺（cetrimide）0.2g及萘啶酸（nalidixic acid）15mg（商稱NAC），瓊脂15g，加蒸餾水1000m1，pH為7.4。
在NAC培養(yǎng)基中，綠膿桿菌生長良好，有些熒光假單胞菌，惡臭假單胞菌和腐敗假單胞菌可緩慢生長或不長，而大腸埃希氏菌、志賀氏菌、沙門氏菌、變形桿菌、克雷伯氏菌和腸道桿菌科的其他菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、氣單胞菌屬、弧菌屬以及葡萄球菌和鏈球菌屬等，完全受到抑制不能生長。因此NAC培養(yǎng)基是一種選擇性很強(qiáng)的綠膿桿菌培養(yǎng)基。日本采用NAC培養(yǎng)基分離化妝品中綠膿桿菌。 CTFA采用十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基分離綠膿桿菌。在我國化妝品標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中規(guī)定十六烷三甲基溴化銨和乙酰胺二種培養(yǎng)基均可使用，這是考慮到有的地區(qū)十六烷三甲基溴化銨不易買到。
2、綠膿桿菌與其他常見假單胞菌及革蘭氏陰性桿菌的鑒別。
假單胞菌屬分為四個(gè)菌群：29個(gè)代表菌種。其中同人類與動(dòng)物疾病有重要關(guān)系的大約有10種，而綠膿桿菌（pseudomonas aeruginosa）又是其中最有代表性的致病菌種。常見的其他菌種有：熒光假單胞菌（PS flaorescens）、惡臭假單胞菌PS Putida）、蔥頭假單胞菌（PS cepacia）、類鼻疽假單胞菌（PS Pseudomallei）、嗜麥芽假單胞（PS maitophilia）、腐敗假單胞菌（PS Putretf aciens）、斯氏假單胞菌（PS Stutzeri）、產(chǎn)堿假單胞菌（PS alcaligenes）和類產(chǎn)堿假單胞菌（PS Pseudoalcaligenes）等九種。此外，在日常檢驗(yàn)工作中尚有一些非假單胞菌屬的其他革蘭氏陰性桿菌，如氧化木糖無色桿菌（A xy-losoxidans）、產(chǎn)堿桿菌屬(AlcaligenesSP)和糞產(chǎn)堿桿菌（A faecalis）等均容易與上述假單胞菌混淆，主要鑒別列表3-1-3中。
3、綠膿桿菌血清學(xué)試驗(yàn)
在微生物諸多研究方法中，血清學(xué)方法是重要方法之一，被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)診斷中。
對(duì)綠膿桿菌血清分型的研究，早在1903年Eisenberg就已致力于這一工作。我國也進(jìn)行了大量工作，以O(shè)抗原為依據(jù)，研制成了國際抗原分型系統(tǒng)（IATS）20型分型血清，分型率達(dá)99.4％，是當(dāng)前各國分型系統(tǒng)中分型率高的分型方案。
綠膿桿菌血清學(xué)試驗(yàn)采用玻片凝集法。先用PI～P多價(jià)血清分別與待檢活菌培養(yǎng)物作凝集試驗(yàn)，陽性者再用單價(jià)分型血清作凝集試驗(yàn)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：立即出現(xiàn)強(qiáng)凝集（＋＋＋＋），3～5ｓ出現(xiàn)強(qiáng)凝集（＋＋＋），6～10s出現(xiàn)凝集（＋＋）， 11～15s出現(xiàn)凝集（＋）,16～30s不出現(xiàn)凝集（一），以（＋＋）以上為陽性結(jié)果。
對(duì)綠膿桿菌既作生化鑒定,又作血清凝集試驗(yàn),更有利于結(jié)果的判定。
4、檢驗(yàn)報(bào)告
1）用十六烷三甲基溴化胺瓊脂平板或乙酰胺瓊脂平板分離的疑似綠膿桿菌菌落，經(jīng)染色鏡檢為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，氧化酶陽性并產(chǎn)生綠膿菌色素的，應(yīng)報(bào)告檢出綠膿桿菌。
2）如果分離的疑似菌株為革蘭氏陰性無芽胞桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽性，不產(chǎn)生綠膿菌色素，而能液化明膠，硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42生長試驗(yàn)皆為陽性的，也應(yīng)報(bào)告檢出綠膿桿菌。
3）凡符合以下情況之一者，應(yīng)報(bào)告未檢出綠膿桿菌；
從增菌液中未分離出任何菌落；
分離的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，氧化酶試驗(yàn)陰性；
證明不產(chǎn)綠膿菌色素，氧化酶陽性的革蘭低陰性無芽胞桿菌，不液化明膠，硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42生長試驗(yàn)均為陰性的細(xì)菌。
