現(xiàn)代生物技術均通過細胞作為載體來進行，無論是基因治療、干細胞、克隆技術都在細胞內(nèi)進行的。細胞的生長需要一定的營養(yǎng)環(huán)境，用于維持細胞生長的營養(yǎng)基質(zhì)稱為培養(yǎng)基，即指所有用于各種目的的體外培養(yǎng)、保存細胞用的物質(zhì)，就其本意上講為人工模擬體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境，使細胞在此環(huán)境中有生長和繁殖的能力。它是提供細胞營養(yǎng)和促進細胞生長增殖的物質(zhì)基礎。細胞培養(yǎng)基其組成成分主要有：水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子及其他一些入核酸降解物、激素等。
隨著動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術的迅速發(fā)展，作為細胞培養(yǎng)領域中最基本的原料－細胞培養(yǎng)基的用量也迅速增加，被廣泛應用于細胞生物學科和醫(yī)學研究的各個領域，如疫苗生產(chǎn)（人用疫苗如乙腦、狂犬、甲肝、乙肝、出血熱、麻疹等，獸用疫苗如口蹄、馬立克、偽狂犬等），基因藥物生產(chǎn)（如EPO、TPA等），臨床用單抗（如抗人肝癌單抗、抗人肺單抗、WT3）等。
第一節(jié) 水與平衡鹽溶液
1.培養(yǎng)用水:體外培養(yǎng)的細胞對水質(zhì)特別敏感，對水的純度要求較高。培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微，有時也會影響細胞的存活和生長，甚至導致細胞死亡。用金屬蒸餾器制備的蒸餾水，可能會含有某些金屬離子，一般不作為培養(yǎng)用水。配制培養(yǎng)用液應使用經(jīng)石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水。最好用龍頭瓶貯存，存放時間一般不應超過2周。
2.緩沖溶液、生理鹽水、平衡鹽溶液：稍后介紹。
第二節(jié) 細胞培養(yǎng)基的基本要求
體外培養(yǎng)的細胞直接生活在培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基應能滿足細胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。
一、營養(yǎng)成分 維持細胞生長的營養(yǎng)條件一般包括以下幾個方面：
1.氨基酸：是細胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細胞都需要12種必須氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺，它在細胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質(zhì)。 體外培養(yǎng)的各種培養(yǎng)基內(nèi)都含有必需氨基酸。
2.單糖：培養(yǎng)中的細胞可以進行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細胞對葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。
體外培養(yǎng)動物細胞時，幾乎所有的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。
3.維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。
4.無機離子與微量元素：細胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。
二、促生長因子及激素 已證實：各種激素、生長因子對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態(tài)（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素對許多細胞生長有促生長作用，如胰島素，它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對某一類細胞有明顯促進作用，如氫化可的松可促進表皮細胞的生長，泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。
三、滲透壓 細胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養(yǎng)人體細胞的理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數(shù)哺乳動物細胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。
四、pH 氣體也是細胞生存的必需條件之一，所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生能量供給細胞生長、增殖和合成各種成分。一些細胞在缺氧情況下，借糖酵解也可獲取能量，但多數(shù)細胞缺氧不能生存。在開放培養(yǎng)時，一般置細胞于95％空氣加5％二氧化碳的混合氣體環(huán)境中培養(yǎng)。二氧化碳既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞所需成分，它主要與維持培養(yǎng)基的pH有直接關系。動物細胞大多數(shù)需要輕微的堿性條件，pH值約在7．2~7．4℃在細胞生長過程中，隨細胞數(shù)量的增多和代謝活動的加強，二氧化碳不斷被釋放，培養(yǎng)液變酸，PH值發(fā)生變化。由于NaHCO3容易分解為二氧化碳，很不穩(wěn)定，致使緩沖系統(tǒng)難以精確地控制。故這一緩沖系統(tǒng)適合密閉培養(yǎng)。HEPES結(jié)合碳酸氫鈉使用，可提供更有效的緩沖體系，主要是防止pH值迅速變動，但最大缺點是在開放培養(yǎng)或觀察時難以維持正常的pH值。造成pH波動主要是代謝產(chǎn)生的CO2，在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。為解決這一問題，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)，并采用開放培養(yǎng)，使細胞代謝產(chǎn)生的CO2及時溢出培養(yǎng)瓶，再通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2濃度（5％），與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。
五、無毒、無污染 體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有抵抗能力，因此培養(yǎng)基應達到無化學物質(zhì)污染、無微生物污染（如細菌、真菌、支原體、病毒等）、無其他對細胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補體）。對于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應當嚴格選材，嚴格操作。對于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應十分潔凈，配制后應嚴格過濾除菌。
第三節(jié) 天然細胞培養(yǎng)基
天然培養(yǎng)基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。組織培養(yǎng)技術建立早期，體外培養(yǎng)細胞都是利用天然培養(yǎng)基。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的天然培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進細胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細胞也是必不可少。
一、血清(serum)細胞培養(yǎng)的發(fā)展，培養(yǎng)基的質(zhì)量又是關鍵，而培養(yǎng)基的主要成份中動物血清對細胞的生長繁殖發(fā)揮著重要甚至是難以替代的作用。在動物血清的應用中牛血清又是最為廣泛的，所以血清是醫(yī)藥生物技術產(chǎn)品中重要的原材料之一。保證血清質(zhì)量也是促進生物制品質(zhì)量提高的重要環(huán)節(jié)。
1.血清種類:目前用于組織培養(yǎng)的血清主要是牛血清，培養(yǎng)某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。選擇用牛血清培養(yǎng)細胞的原因：來源充足、制備技術成熟、經(jīng)過長時間的應用考驗人們對其有比較深入的理解。牛血清對絕大多數(shù)哺乳動物細胞都是適合的，但并不排除在培養(yǎng)某種細胞時使用其他動物血清更合適。
牛血清是細胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。牛血清分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應取自剖腹產(chǎn)的胎牛；新牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。顯然，胎牛血清是品質(zhì)最高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。
2.血清的主要成分:血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已知，但還有一部分尚不清楚，且血清組成及含量常隨供血動物的性別、年齡、生理條件和營養(yǎng)條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質(zhì)對促進細胞生長或抑制生長活性是達到生理平衡的。對血清的成分和作用的研究雖有很大進展，但仍存在一些問題。主要是：
第一:血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚，尤其是對其中一些多肽類生長因子、激素和脂類等尚未充分認識，這給研究工作帶來許多困難；
第二:血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相似性極為困難，從而使實驗的標準化和連續(xù)性受到限制；
第三:不能排除血清中含有易變物質(zhì)，這被認為是“瓶中惡化”的原因之一。
3.血清主要作用：
●提供基本營養(yǎng)物質(zhì)：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質(zhì)、核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質(zhì)。
●提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素（氫化可的松、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。
●提供結(jié)合蛋白：結(jié)合蛋白作用是攜帶重要地低分子量物質(zhì)，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉(zhuǎn)鐵蛋白攜帶鐵。結(jié)合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。
●提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。
●對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用：有一些細胞，如內(nèi)皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經(jīng)被廣泛用于貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養(yǎng)攪拌時，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。
4.細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點
血清成分復雜，雖含許多對細胞有利成分，也含有對細胞有害的成分，使血清有幾個明顯的缺點：
●對大多數(shù)細胞，在體內(nèi)狀態(tài)，血清不是它們接觸的生理學液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)，血清可能促進某些細胞的生長（成纖維細胞）同時抑制另一類細胞生長（表皮細胞）。
●血清含一些對細胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應（如精胺、亞精胺）形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡。
●動物個體不同，血清產(chǎn)地、批號不同，每批質(zhì)量差異甚大，其成分不能保持一致。
●取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產(chǎn)生潛在影響，可能導致實驗失敗或?qū)嶒灲Y(jié)果不可靠性。
●血清的使用使得實驗和生產(chǎn)的標準化困難，其中的蛋白質(zhì)使得某些轉(zhuǎn)基因蛋白生物藥品生產(chǎn)中分離純化工作很難完成。
●大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構成動物細胞培養(yǎng)對生產(chǎn)成本的主要部分之一。
5.血清的質(zhì)量標準:血清質(zhì)量高低取決于兩方面因素：一是取材對象，二是取材過程。用于取材的動物應健康無病并且在指定的出生天數(shù)之內(nèi)，取材過程應嚴格按照操作規(guī)程執(zhí)行，制備出的血清要經(jīng)過嚴格的質(zhì)量鑒定。WHO公布的《用動物細胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求：
▲牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應具備適當?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng)。
▲有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。
▲證明所用牛血清中不含對所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。
▲血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。
▲無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細菌噬菌體污染。
▲對細胞有良好的支持繁殖作用。
我國在對牛血清的質(zhì)量2000年版《中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標準》中提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質(zhì)含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內(nèi)毒素，支持細胞增殖檢查。
血清質(zhì)量的鑒定一般包括以下幾個方面：
●理化性質(zhì)：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應小于20g/L)、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項非常重要的指標，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅蛋白也是越低越好。
●微生物檢測：包括細菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測，支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22u的濾膜。支原體、病毒污染在光學顯微鏡下難于察覺，細胞也能生長繁殖，但會影響實驗結(jié)果。檢測支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。
●促生長效果：這是血清重要的特性之一，應當以培養(yǎng)的細胞來檢測。有兩種方法：克隆形成率、貼瓶率測定法和連續(xù)傳代培養(yǎng)法。
(1)克隆形成率測定:一般以懸浮生長的細胞為培養(yǎng)對象，按有限稀釋法做克隆化培養(yǎng)，將不同批號的血清配制成不同濃度的培養(yǎng)基，細胞也稀釋成不同濃度，接種到96孔板，每孔200ul，培養(yǎng)一定時間，統(tǒng)計有克隆生長的孔，計算出百分比，再與對照的標準血清相比較，就可看出不同批號血清間的區(qū)別。比較低的濃度，更能觀察出血清質(zhì)量間的細微差別。
(2)貼瓶率測定:是以貼壁細胞為培養(yǎng)對象，將細胞稀釋至低密度，接種至平皿，每皿200或100個細胞，以不同濃度的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)一定時間后棄培養(yǎng)基，染色后統(tǒng)計集落數(shù)，計算出集落數(shù)占接種細胞數(shù)的百分比，同樣再與標準血清比較，判斷血清質(zhì)量高低。
(3)連續(xù)傳代培養(yǎng)法:是將細胞培養(yǎng)于3個一定體積的培養(yǎng)瓶中，待測血清配制為5％濃度，一般于第七天收集細胞，計數(shù)，取平均值，中間可以更換一次培養(yǎng)基。連續(xù)測試三個周期以上，觀察細胞生長狀況，并將每次的計數(shù)結(jié)果與標準血清的測試結(jié)果比較。
●對于使用者，判斷血清質(zhì)量先從外觀入手。好的血清應該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如發(fā)現(xiàn)血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性；若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時有溶血現(xiàn)象；如果搖晃時感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。如果要進一步了解血清的質(zhì)量，則應連續(xù)培養(yǎng)某些細胞，觀察細胞生長狀況。
6.血清的使用與儲存:正確的使用及保存血清，才能使血清發(fā)揮應有的作用。
●使用前處理：大部分血清在使用前必須滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的是去除血清中的補體成分，避免補體對細胞產(chǎn)生毒性作用。血清經(jīng)過滅活也會損失一些對細胞有利的成分，如生長因子，因此也有人提出血清不經(jīng)滅活直接用于培養(yǎng)，這樣做的前提是確認血清中不含補體成分。對于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細胞培養(yǎng)。
●儲存條件：血清一般儲存于－20℃，同時應避免反復凍融。購買大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于－20℃，使用前融化。融化時最好現(xiàn)置于4℃。融化后的血清在4℃不宜長時間存放，應盡快使用。
●使用濃度：自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5－20％，最常用是10％。過多血清容易使培養(yǎng)中的細胞發(fā)生變化，特別是一些二倍體的無限細胞系，迅速生長之后容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。
●采購血清時，最好先從供應商處索取樣品進行試驗，選定一批后就要保留足夠使用6個月至1年的量，直至用另一批經(jīng)過預先試驗的樣品代替。
二、胚胎浸出液
胚胎浸出液(embryonic extract)是早期動物細胞培養(yǎng)中應用的天然培養(yǎng)基，現(xiàn)已很少使用。
三、水解乳蛋白 水解乳蛋白(lactalbumin hydrolysate)為乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含有豐富的氨基酸，是常用的天然培養(yǎng)基，可用于許多細胞和原代細胞的培養(yǎng)。
第四節(jié) 合成細胞培養(yǎng)基
合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學物質(zhì)模擬合成、人工設計、配制的培養(yǎng)基。它有一定的配方，是一種理想的培養(yǎng)基。目前合成培養(yǎng)基多達10多余種，有的培養(yǎng)基仍在不斷進行改良。早期組織培養(yǎng)是利用天然培養(yǎng)基，目前合成培養(yǎng)基已經(jīng)成為一種標準化的商品，從最初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基，并且還在不斷發(fā)展。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)極大的促進了組織培養(yǎng)技術的普及發(fā)展。
一、基本組分 基本培養(yǎng)基包括四大類物質(zhì)：無機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。
●無機鹽：CaCl2 KCl MgSO4 NaCl NaHCO3 NaH2PO4。對調(diào)節(jié)細胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。
●氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它們都是細胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成。除此之外，還需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，對細胞的培養(yǎng)特別重要，能促進各種氨基酸進入細胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，還是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏可導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應補加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中最好單獨配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液中。
●維生素：是維持細胞生長的一種生物活性物質(zhì)，在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對細胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補充。水溶性維生素包括牛物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素C也是不可缺少的，對具有合成膠原能力的細胞更為重要。
●碳水化合物：是細胞生命的能量來源，有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養(yǎng)動物細胞時，幾乎所有培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。
●葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用：乳酸是葡萄糖不完全氧化的產(chǎn)物。研究表明，體外培養(yǎng)條件下95％的葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，這降低了營養(yǎng)物質(zhì)的代謝效率，降低培養(yǎng)基pH值，增加滲透壓。在氧氣供給不足的情況下，NADH轉(zhuǎn)運系統(tǒng)蘋果酸－天冬氨酸穿梭系統(tǒng)活性低而不能將糖酵解產(chǎn)生的NADH氧化磷酸化為NAD+，細胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脫氫酶將糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸與NADH反應生產(chǎn)乳酸和NAD+，從而保證了糖酵解的順利進行。另一個可能的解釋是連接糖酵解與TCA循環(huán)的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下，直接導致糖酵解與TCA循環(huán)的失衡。因此體外培養(yǎng)條件下，葡萄糖主要經(jīng)糖酵解降解，產(chǎn)生過量的乳酸。減少乳酸生產(chǎn)最常用的方法是限制培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量過低可造成細胞營養(yǎng)供應不足，細胞生長抑制。該方法需要對葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產(chǎn)速率以及目的蛋白的表達量等參數(shù)進行綜合考慮方可應用。
在目前常用的培養(yǎng)基中，葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養(yǎng)動物細胞的主要能源，其能量代謝通路與體內(nèi)完全不同，表現(xiàn)為葡萄糖主要經(jīng)糖酵解途徑為細胞提供能量，谷胺酰胺大部分通過不完全氧化途徑，另一小部分通過完全氧化為細胞供能。因此，適當?shù)恼{(diào)整細胞內(nèi)的代謝途徑，使之能促進細胞的快速生長和產(chǎn)物合成，同時減少代謝抑制物的生成是行之有效的一種策略。
許多動物細胞如CHO、BHK和雜交瘤細胞對營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而對于細胞生長而言，二者的快速利用并非細胞必需；相反相當一部分轉(zhuǎn)化為代謝廢物乳酸和氨，以及一些非必需氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是兩種主要代謝廢物，其積累可影響細胞生長以及產(chǎn)品質(zhì)量。減少這兩種代謝產(chǎn)物的積累，是大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術研究的重要方向。
氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺產(chǎn)生的。限制培養(yǎng)基中谷氨酰胺的含量亦是減少氨生成的常用方法。
●除了以上與細胞生長有關的物質(zhì)以外，培養(yǎng)基中一般還要加入酚紅（當溶液酸性時pH小于6.8呈黃色；當溶液堿性時pH大于8.4呈紅色），一種pH指示劑。
●在較為復雜的培養(yǎng)液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類)以及氧化還原劑(如谷胱甘肽)等。有的培養(yǎng)液還直接采用了三磷酸腺苷和輔酶A。
二、常用細胞培養(yǎng)基
(1).MEM細胞培養(yǎng)基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(2).DMEM細胞培養(yǎng)基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(3)RPMI-1640細胞培養(yǎng)基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(4).199細胞培養(yǎng)基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(5).水解乳蛋白細胞培養(yǎng)基（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(6)歐氏平衡鹽（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(7)F-10,F-12細胞培養(yǎng)基系列（參看本網(wǎng)站-產(chǎn)品展示）
(8)其它類型細胞培養(yǎng)基
三、干粉培養(yǎng)基的配制
配制培養(yǎng)基要注意以下問題：
●認真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實驗需要決定。
●配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。
●配制所用的水應是三蒸水，離子濃度很低。
●所用器皿應嚴格消毒。
●配制好的培養(yǎng)基應馬上過濾，無菌保存于4度。
●液體培養(yǎng)基主要是為了科研工作的方便而設計的培養(yǎng)基，它是一種滅菌后保證無菌的溶液，必要時可制成無內(nèi)毒素等的溶液，可節(jié)省科研人員的工作量。
配制方法
●在一個盡可能接近總體積的容器中加入比預期培養(yǎng)基總體積少5％的雙蒸水。
●在室溫（20℃到30℃）的水中加入干粉培養(yǎng)基，輕輕攪拌，不要加熱。
●水洗包裝袋的內(nèi)部，轉(zhuǎn)移全部的痕量干粉到容器內(nèi)。
●加NaHCO3到培養(yǎng)基中。
●用雙蒸水稀釋到想要的體積，攪拌溶解。注意不要過分攪拌。
●通過緩慢攪拌加入1N NaOH 或1N HCL調(diào)節(jié)pH值，由于pH值在過濾時會上升0.1到0.3，因 而調(diào)節(jié)pH值使它比最終想要的pH值低0.2到0.3。培養(yǎng)基在過濾前要保持密封。
第五節(jié) 無血清技術及其培養(yǎng)基
經(jīng)歷了天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基后，無血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)成為當今細胞培養(yǎng)領域的一大趨勢。采用無血清培養(yǎng)可降低生產(chǎn)成本，簡化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害。
無血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎培養(yǎng)基加少量血清所配制的完全培養(yǎng)基可以滿足大部分細胞培養(yǎng)的要求，但對有些實驗卻不適合，如觀察一種生長因子對某種細胞的作用，這時需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。因此研制出無血清培養(yǎng)基一直是生物科學工作者努力的目標。上海恒利安生物科技有限公司已成功開發(fā)了商業(yè)化的多種無血清培養(yǎng)基，可滿足眾多廠商的需求。
一、無血清培養(yǎng)基的基本配方:基本成分為基礎培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。
用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細胞在體外培養(yǎng)時，多數(shù)呈貼壁生長或兼性貼壁生長；而當其在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中生長時，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細胞往往以懸浮形式生長。
添加組分包括以下幾大類物質(zhì)：
(1）促貼壁物質(zhì)：許多細胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴展因子，一般為細胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質(zhì)細胞、CHO細胞、成肌細胞等。
(2）促生長因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細胞必不可少的，如胰島素。
(3）酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中必不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制劑。
(4）結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白：常見如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。
(5)微量元素：硒是最常見的。
二、使用方法:目前，血清仍是動物細胞培養(yǎng)中最基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，待細胞生長旺盛以后，再換成無血清培養(yǎng)液。細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個適應過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學特性等。在實驗后這些細胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細胞的特性不發(fā)生變化。
為了使細胞適應無血清培養(yǎng)，關鍵的是使所培養(yǎng)細胞：
●處于對數(shù)生長中期
●>90% 活細胞率
●適應時以較高的起始細胞接種
有兩種方法使細胞適應無血清培養(yǎng)基（SFM）:
1. 直接適應——細胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中。
一些類型細胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應無血清培養(yǎng)基。對于直接適應，接種細胞密度應該:2.5×105~3.5×105細胞/ml。當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml時，傳代培養(yǎng)細胞。當細胞密度在培養(yǎng)4到7天后達到2×106~4×106細胞/ml時，細胞完全適應了無血清培養(yǎng)基。每隔3~5天，當細胞密度達到1×106~3×106細胞/ml，細胞活率在90％時，貯備的適應了無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物應該再次傳代培養(yǎng)。
2. 連續(xù)適應——分好幾步把細胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中，與直接適應相比較，連續(xù)適應趨向?qū)τ诩毎訙睾鸵恍?span lang="EN-US">
●以2倍正常接種密度接種生長活躍的細胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基：25％SFM 混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。
●當細胞密度>5×105細胞/ml時，以2×105到3×105細胞/ml細胞密度，在有血清培養(yǎng)基：SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
●以2×106到3×106細胞/ml細胞密度，25％有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。
●當細胞密度達到1×106到3×106細胞/ml（接種后4到6天），在100％SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
●每隔3到5天，當細胞密度達到1×106到3×106細胞/ml，細胞活率在90％時，貯備的適應了無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物應該再次傳代培養(yǎng)。
建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細胞適應了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進行幾次傳代。
在適應過程中，最好不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。
細胞培養(yǎng)適應替代血清：許多細胞利用連續(xù)適應方法能很好的適應，用包含FBS的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1（v∶v）的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。通過下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當前培養(yǎng)基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培養(yǎng)基。每次適應改變血清比例時，傳代細胞2到3次。
培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長的延遲可能會發(fā)生，4允許進行2到3次的傳代，使生長率恢復到以前的水平。
特別需要強調(diào)的是：配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對細胞產(chǎn)生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關鍵因素之一。
三、使用無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點
●增加確定性
●性能更加一致
●容易進行純化和下游加工
●細胞功能的精確評估
●增強生長和/或產(chǎn)量
●生理反應性的較好對照
●增強細胞內(nèi)中介物的檢測
第六節(jié) 無蛋白培養(yǎng)基與限定化學成分培養(yǎng)基
一、無蛋白培養(yǎng)基（protein free midium,PFM）:即不含有動物蛋白的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基仍含有較多的動物蛋白，如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術發(fā)展的趨勢來看，不含動物蛋白的培養(yǎng)基又廣泛的應用前景，許多利用基因工程技術重組的蛋白質(zhì)最終要應用于人體，如果再生長過程中使用了含有動物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過程就比較復雜，最終要達到一定的質(zhì)量標準也有一定的難度。無蛋白培養(yǎng)基就是為了適應這發(fā)展趨勢而出現(xiàn)的，許多無蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動物激素、生長因子的作用。市場上已有適合多種細胞生長的無蛋白培養(yǎng)基。
二、限定化學成分培養(yǎng)基(chemical defined medium,CDM):是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有動物蛋白，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于293細胞、CHO細胞、雜交瘤細胞生長的CDM問世，上海恒利安生物科技有限公司生產(chǎn)的水解乳蛋白培養(yǎng)基就屬于CDM。
第七節(jié) 其他細胞培養(yǎng)用液
在細胞培養(yǎng)過程中，除了培養(yǎng)基外，還經(jīng)常用到一些平衡鹽溶液、消化液、pH調(diào)整液等。
一、平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS）:主要是由無機鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。主要用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。最簡單的BSS是Ringer。D-Hank's與Hank's的一個主要區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO2的培養(yǎng)條件，Hank's平衡液僅含有0.35g/L NaHCO3，不能用于5%CO2的環(huán)境，若放入CO2培養(yǎng)相，溶液將迅速變酸，使用時應注意。
配制溶液應使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應當首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。
二、消化液:取材進行原代培養(yǎng)時常常需要將組織塊消化解離形成細胞懸液，傳代培養(yǎng)時也需要將貼壁細胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有時也用膠原酶（collagenase）溶液。
1.胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液（如前面的D-Hank's），因為這些物質(zhì)會對胰酶產(chǎn)生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH是8-9，配制胰酶溶液應將液體調(diào)至pH8左右，充分溶解，過濾除菌。過濾后可以再調(diào)只pH7.5，也可不調(diào)。
使用細胞清洗液配制胰酶消化液：含0.5%胰酶的細胞清洗液（100ml細胞清洗液加0.5g胰酶），過濾除菌，分裝于4度保存。
2.EDTA溶液：EDTA溶液也常用來解離細胞，它的作用機制是破壞細胞間的連接。對于一些貼壁特別牢固的細胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時應加堿助溶，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。
3.膠原酶溶液：膠原酶在上皮類細胞原代培養(yǎng)時經(jīng)常使用，膠原酶作用的對象是膠原組織，因此不容易對細胞產(chǎn)生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或200000U/L,作用的最佳pH為6.5。膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制時可用PBS。
三、pH調(diào)整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。
1.NaHCO3溶液：NaHCO3是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準確添加，以保證培養(yǎng)基在5%CO2的環(huán)境下pH達到設計標準。如果是封閉式培養(yǎng)，即不與5%CO2的環(huán)境發(fā)生交換達到平衡，所使用的培養(yǎng)基就不能按照說明書所要求加入NaHCO3。此時常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，使之達到所要求的pH環(huán)境。
2.HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細胞無毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES。
四、抗生素:常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預防絕大多數(shù)細菌污染。通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/100ml,鏈霉素終濃度0.01g/100ml。一般配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養(yǎng)基配制。
五、谷氨酰胺補充液:谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養(yǎng)液內(nèi)。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配制時應加溫30℃，完全溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲存于－20℃。使用時，在每100ml培養(yǎng)液中加入0.5~2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1~4mmol/L。
六、二肽谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）
在細胞培養(yǎng)液中L-谷氨酰胺是大部分細胞培養(yǎng)基的基本成分；而L-谷氨酰胺是一種并不穩(wěn)定的氨基酸，在中性的水溶液中會自發(fā)降解；需要頻繁地補加L-谷氨酰胺。因而在培養(yǎng)操作過程中經(jīng)常：
（1）頻繁打開蓋子，增加了破壞無菌狀態(tài)的可能性；
（2）過多的追加L-谷氨酰胺，增加了培養(yǎng)基中氨的毒性水平。
二肽谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中穩(wěn)定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨最少!
二肽谷氨酰胺在細胞內(nèi)被氨肽酶（E.C.3.4.11.2）所水解，產(chǎn)生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大部分細胞系統(tǒng)中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。二肽谷氨酰胺是最優(yōu)替代物，它無需適應；既可用于貼壁細胞培養(yǎng)，也適合于懸浮細胞的培養(yǎng)。
