細胞培養(yǎng)經(jīng)驗談
細胞生存所需營養(yǎng)和添加物
l 氨基酸 合成蛋白質(zhì)。
l 糖 葡萄糖為主，提供能量代謝。
l 激素 很多激素具有促細胞生長作用
l 谷氨酰胺 促進氨基酸進入細胞膜，是核酸的成分。（注意：備用培基放置15天后需要補充谷氨酰胺）
l 抗菌素 青霉素100單位/ 毫升、鏈霉素100微克/毫升，制霉菌素25單位/毫升。
l 微量元素
l 生物刺激源 有些細胞須特殊刺激因子，例ECGF、NGF、TGF、FGF、HGF、EGF等。
l 生長基質(zhì)成分 膠原、纖維連接蛋白、明膠、多聚賴氨酸。
l 細胞生長的密度依賴性 單個細胞不易生長，要加同種動物巨噬細胞補充密度，一般用腹腔巨噬細胞，105/ml。
血清：
l 1.促細胞生長因子，維生素, 激素及營養(yǎng)物質(zhì)，其中的蛋白可解除脂肪酸、重金屬離子、蛋白酶對細胞的毒性作用。
l 2.促進細胞貼壁。
l 3.小牛血清和胎牛血清應用最多，有的血清對細胞有毒性，要篩選。胎盤血清較成人血清好（胎盤血清含豐富的生長激素）
l 4.AB型血清無凝集素，可廣泛使用自身血清在自身細胞培養(yǎng)時應用較好。
l 5.馬血清、雞血清在某些細胞培養(yǎng)時應用。
l 應用：須無菌，不溶血，分裝保存
無菌操作
l 無菌室每周用過氧乙酸加紫外線消毒1一2次，
l 實驗前，將實驗器材放入超凈臺，同時啟動風機紫外線照射30分鐘后消毒完畢，使凈化臺內(nèi)空氣和臺面構(gòu)成無菌環(huán)境。
l 手指不能觸及器材使用端，若碰到要更換。減少手與器材的接觸面積，
l 一切操作都要在火焰周圍進行，避免手從瓶口或其他器材上方經(jīng)過，瓶口要經(jīng)火焰消毒。
l 培養(yǎng)用液要專管專用，勤換吸管，防止擴大污染和交叉污染。
l 操作者動作要準確敏捷，盡量避免空氣流動。
組織分離方法：
l 離心法：羊水，胸腹水、骨髓等，用細胞分離液進行密度梯度離心分離細胞。
l 組織切割法：無菌剝離脂肪及結(jié)締組織，用含抗菌素的培養(yǎng)液洗滌去血液，用眼科剪剪成
l 消化分離法：
l a 胰蛋白酶消化法: 用不含Ca++、Mg++的PBS配成0.1—0.25%的濃度，PH7.6，多用于貼附細胞傳代。在做原代組織培養(yǎng)時可用胰酶松散組織，但不得超過30分鐘。蛋白可吸附此酶，因此被消化的細胞要先洗去培養(yǎng)液。
l b. 膠原酶消化法：主要用于纖維間質(zhì)多的組織、軟骨組織的消化，不受Ca++，Mg++影響，濃度0.1－0.3%，
l c. EDTA消化應不含Ca++、Mg++，EDTA可與Ca++、Mg++結(jié)合使細胞松散。濃度0.02％。
細胞消化傳代
l 消化液 0.25％胰蛋白酶或0.1％胰酶含0.02%EDTA。
l 方法 1.懸浮細胞采用離心法傳代或直接傳代法。2.貼壁細胞傳代用酶消化法：即平衡鹽溶液洗滌細胞二次，加消化液，以剛好覆蓋細胞為宜。放入
細胞凍存與復蘇
為了長期保存細胞、須凍存，可存數(shù)年。
l 凍存液： 培養(yǎng)液7份，血清2份，二甲基亞砜（DMSO）1份， 。
l 凍存方法： 凍存細胞的前一天換培養(yǎng)液，貼壁細胞經(jīng)常規(guī)消化，洗滌，調(diào)整細胞濃度約106/ml, 用彈指法將細胞打散，逐滴加入冷的凍存液，迅速加入凍存管中，1.5ml/管。做好標記，
l 復蘇方法: 備
細胞運輸
l 1.長距離運輸 選擇生長良好的單層細胞加培養(yǎng)液至瓶頸，保留微量空氣，擰緊瓶蓋，用膠帶封好，包裹棉花，放在貼身口袋即可。到達目的地，吸出多于培養(yǎng)液（此液可繼續(xù)使用），按常規(guī)培養(yǎng)。
l 2.短距離運輸 （幾小時）僅留少量培養(yǎng)液，防止細胞干燥，將細胞面朝上帶回。
培養(yǎng)中細胞生長情況的識別
l 細胞生長
貼壁細胞增殖向周圍擴張，互相融合連成片，可見細胞隆起飽滿。 懸浮細胞呈圓形，具有折光性，大小不一，細胞壁光滑，透明無顆粒，細胞增殖旺盛時培養(yǎng)液易變酸。應及時更換培養(yǎng)液。
l 細胞死亡
表現(xiàn)：貼壁細胞開始回縮變圓或成細絲狀，細胞間隙增大，胞壁增厚，胞內(nèi)顆粒增加，粗糙，脫落，崩潰解體。懸浮細胞無光澤，胞內(nèi)顆粒呈棕黑色，最后液化消失。
原因：污染，PH不適，谷氨酰胺過期，血清質(zhì)量不佳，培養(yǎng)液過期和未及時換培養(yǎng)液，膠塞燒燃產(chǎn)生毒物，支原體污染，培養(yǎng)器皿不干凈，水不純等復雜原因。
商用細胞庫
美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC) 。
地址： American Type Culture Collection， Rockville, maryland 20852,USA。
ATCC網(wǎng)址：http//www.atcc.org/
中國典型培養(yǎng)物保藏中心( China Center Type Culture Collection， CCTCC)
地址：武漢大學生命科學院中國典型培養(yǎng)物保藏中心(郵政編碼430072)聯(lián)系電話：027－87682378
中科院細胞庫 網(wǎng)址http//www.cell.ac.cn/cellbank/。
地址：上海岳陽路320號中國科學院上海細胞所細胞庫
（郵政編碼：200031）。聯(lián)系電話：021－64315030－2052
細胞培養(yǎng)用品的消毒和處理
l 玻璃用品清洗：（新玻璃用品用5%鹽酸浸泡）清水沖洗→洗滌劑刷→清水→干→清潔液（重鉻酸鉀
l 塑料用品回收性清洗：
清水沖洗→洗滌劑刷→清水→干→清潔液（重鉻酸鉀
l 濾器：生物制劑均應過濾除菌。一次性濾器不能回收，有大小不等規(guī)格。
l 橡皮塞： 肥皂煮→清水洗，不要用腐蝕性液體浸泡，不宜高壓，微波煮5-10min除菌。
空氣消毒：紫外線，乳酸蒸氣。
